Organismo knock-out

• In gergo scientifico, un knock-out (KO) è un organismo studiato in laboratorio in cui uno specifico gene è stato soppresso tramite tecniche di ingegneria genetica.
• La specie animale maggiormente utilizzata per generare un KO è il topo.
• La generazione dei topi KO si basa su metodi e protocolli che sfruttano tecniche di biologia molecolare e di manipolazione genetica e cellulare.
• Il confronto tra animali non geneticamente modificati e animali KO permette di studiare la funzione del gene di interesse.
• I knock-out condizionali sono animali in cui un gene di interesse è assente solo in alcune, specifiche cellule o in alcune fasi evolutive.

Un animale knock-out (KO) è un organismo transgenico. Sono detti transgenici gli organismi il cui DNA è stato modificato aggiungendo, eliminando o modificando uno o più geni. Nello specifico, i knock-out sono organismi in cui viene reso non funzionale un gene di interesse, attraverso tecniche di ingegneria genetica. Dal confronto tra un animale knock-out e uno non ingegnerizzato, che in gergo è detto “wild type” (WT), è possibile studiare il ruolo del gene rimosso in particolari processi biologici o patologici. Per fare un esempio, se un ricercatore ipotizza che l’attivazione del gene A promuova l’insorgenza del tumore del fegato, andrà a confrontare animali WT in cui il gene A è presente con animali knock-out in cui il gene A è stato rimosso. Se il tumore del fegato risulta più frequente nella popolazione di animali WT nei quali il gene A è presente e attivato, rispetto alla popolazione di animali knock-out in cui il gene A è assente, è possibile che l’ipotesi sia corretta.

Nella quasi totalità dei casi quando si parla di animale knock-out ci si riferisce a topi KO. Esistono altre specie animali e vegetali che possono essere ingegnerizzate per generare knock-out. Tra gli animali, un esempio possono essere i pesci zebra (zebrafish), che tuttavia sono molto meno utilizzati rispetto ai topi. I motivi per cui solitamente si ricorre ai topi sono numerosi: sono organismi molto conosciuti e studiati, anche perché presentano numerosi vantaggi, quali le piccole dimensioni, la facilità di allevamento e i tempi brevi di riproduzione. Inoltre, sono disponibili molti reagenti specifici, per esempio tanti anticorpi monoclonali, che consentono di studiare una vasta gamma di malattie. Non ultimo si prestano bene alla manipolazione genetica.

Il primo passaggio per la generazione di un topo knock-out prevede l’utilizzo di tecniche di biologia molecolare, per sintetizzare una molecola di DNA contenente il frammento che andrà a prendere il posto del gene di interesse. Questo frammento di DNA consiste in una sequenza genica (marcatore di selezione) che serve anche a riconoscere, a posteriori, le cellule correttamente ingegnerizzate. Ai lati di questo frammento si trovano inoltre due regioni, dette regioni di omologia, che fanno sì che, quando il transgene è introdotto nella cellula, si vada a inserire esattamente al posto del gene bersaglio (tramite una tecnica chiamata “gene targeting”).

Per la generazione dei topi knock-out si utilizzano cellule staminali embrionali (cellule ES), ottenute da embrioni di topo allo stadio di blastocisti. Il DNA preparato in laboratorio, detto anche costrutto genetico, viene introdotto nelle cellule ES. Grazie al marcatore di selezione si isolano le cellule ES in cui il gene bersaglio è stato eliminato. Le cellule ES vengono poi reinserite mediante microiniezione in altre blastocisti, che vengono quindi trasferite in madri surrogate.

I topolini che nascono avranno parte delle cellule che derivano dalle cellule ES modificate e parte delle cellule che derivano dalle cellule della blastocisti microiniettata, e sono perciò chiamati chimere. Dato che si utilizzano cellule ES di un ceppo di topo che ha il pelo di colore differente dal ceppo della blastocisti ospite, le chimere hanno il pelo di colore misto. Si selezionano i topolini che hanno il mantello in proporzione più simile a quello del ceppo delle cellule ES: il colore del mantello è dunque un indicatore della probabilità che la modifica di interesse sia stata incorporata nelle cellule della linea germinale e che quindi possa essere trasmessa alla discendenza quando i topini saranno fatti riprodurre. Con gli opportuni incroci si ottiene infine un animale le cui cellule possiedono tutte la mutazione desiderata, il topo knock-out.

In alcuni casi l’eliminazione di un gene è incompatibile con la sopravvivenza di un animale (mutazione letale). Per sopperire a questo problema e potere studiare cellule e tessuti in cui tale gene è soppresso, i ricercatori hanno messo a punto un sistema, detto Cre-loxP, che consente di ottenere knock-out condizionali. I knock-out condizionali sono utili anche per discriminare la funzione di un gene di interesse in un tipo cellulare specifico o in un particolare momento dello sviluppo.

Per ricavare knock-out condizionali occorre generare due linee di topi transgenici. In una delle due linee vengono inserite due sequenze (siti loxP) in corrispondenza del gene bersaglio. Nell’altra linea viene inserito il gene che codifica per l’enzima ricombinasi (Cre) sotto il controllo di una sequenza regolatoria (promotore). La ricombinasi è un enzima che riconosce i siti loxP ed elimina il pezzo di DNA tra loro compreso, causando quindi la rimozione di una parte del gene di interesse e la sua inattivazione. La sequenza regolatoria invece fa sì che la ricombinasi sia espressa solo in alcune cellule (per esempio negli epatociti). Incrociando le due linee di topi si ottengono animali in cui la ricombinasi è attiva solo nelle cellule in cui è espressa. Perciò, per esempio, se si vuole ottenere un knock-out condizionale per il gene A nelle cellule del fegato, si incrocia un topo che esprime Cre negli epatociti con un topo che possiede siti loxP nella sequenza del gene A. Gli animali che possiedono la caratteristica genetica desiderata vengono riconosciuti esaminando il loro DNA mediante PCR o Southern blot; questo processo di screening, in cui si esamina il genotipo degli animali, è detto genotyping.